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作者：Amber Dance /文 李楠/译 来源： 发布时间：2018-7-3 11:42:43
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2015年，伦敦皇家布朗普顿医院重症监护病房接收了几名不明病因的患者。医生怀疑是真菌感染，但是这类疾病很难明确诊断，而且从病人血液样本中培养真菌也需要时间。
于是他们请来了伦敦帝国理工学院的遗传流行病学家Jo Rhodes。借助一个名为MinION的小型DNA测序仪，Rhodes识别出病原体为念珠菌。这是一种新型真菌，2009年在日本首次被发现。通过比较不同患者的病原体序列，她判断疫情可能来自于同一感染源，应该是受污染的设备。她为这种真菌建立了完整的基因组谱图，并将其与美国疾病控制与预防中心在世界各地收集的念珠菌序列进行了对比，确定了伦敦皇家布朗普顿医院的菌株与来自印度或巴基斯坦的其他菌株有关。
Rhodes认为虽然在发现准确的感染源之前，疫情就已经得到有效控制，但是这种快速测序还是可以提供重要的医学信息。例如，测序可以识别出一种氟康唑耐药基因，这将帮助医生避免一种常用但是其实在某些情况下注定徒劳的治疗手段。
个性化医疗并不是这种微生物测序技术的唯一应用场景。加州大学戴维斯分校的进化微生物学家Jonathan Eisen说：“低廉的测序价格已经彻底改变了微生物基因组学。”他指出一种细菌或古细菌完整基因组的测序费用可能不到100美元。研究人员正在收集微生物基因组，以确定与肠道微生物群落相关的多种疾病的病因，这其中包括了从简单的病毒感染到类似癌症的复杂疾病。他们利用这些基因组信息开发新的治疗方案，包括利用微生物本身以及它们的代谢产物。科研人员还在研究许多其他微生物的基因组，比如污染水源的微生物。
对微生物的核糖体RNA （rRNA）基因进行测序可以帮助研究人员在属的层次识别它们。但是，许多研究人员想要获取更全面的数据，例如在单个或一组样本中的多个功能基因序列，这些数据只有全基因组测序才能提供。然后需要利用计算工具来分析碱基对。巴黎Enterome公司首席执行官Pierre Belichard表示：“我们工作的核心是生物信息学”。这家公司正通过研究粪便样本，开发基于肠道微生物的诊断方法和炎症相关疾病的治疗方法（如克罗恩病和癌症）。
有便便吗?
然而，在像Enterome公司的研究人员这样开始处理数据之前，他们要解决一个更基础的问题——获取样本。
在阿肯色州小石城的阿肯色儿童研究所，临床研究员John Slattery和他的同事在研究自闭症谱系障碍（ASD）的病因和生理学。最近，他们很关注肠道菌群，这可能导致许多自闭症患者的胃肠道不适，同时研究人员在这些病人身上观察到线粒体功能障碍的症状。
Slattery想进一步研究ASD患者的肠道菌群，但这里有一个需要解决的问题。粪便捐赠很难获得，因为捐献者需要使用一个称为“收集帽”的笨重容器。对于孩子和他们的家长来说，这真的难以想象。让事情更复杂的是，80%患有ASD的儿童有便秘、腹泻症状，或者是兼而有之。
这就是为什么Slattery如此推崇由科罗拉多州百年城的BioCollective公司开发的生物收集器。它可以方便地挂在马桶盖上，并在收集样品后收起。Slattery评价说：“它就像一件难以置信的礼物，你甚至不用去看着它。”
成立于2015年的BioCollective公司构建了一种不同寻常的合作关系，人们愿意把粪便送给他们做样本，而科学家们想要研究这些样本。会员以39.95美元的价格购买一个生物收集器，当他们收集了粪便样本后就寄给公司，他们的肠道微生物会被rRNA基因测序准确地识别出来。公司还承诺他们，每一份他们的粪便样本在被公司销售给研究机构以后，他们将获得销售利润中的一成。
从另一个角度来说，这些研究人员拥有了简单、高效、低成本的获取粪便样本的途径。这些样本与捐赠者的其他信息完整的呈现在一起，比如他们服用过什么抗生素以及他们承受了哪些压力。公司的首席执行官兼联合创始人Martha Carlin表示，她甚至希望开发一种标准的“参考”样品——一种由健康样本组合而成的“混合粪样”。
此外，BioCollective公司可以提供处于特定状态或摄入特定饮食的人群的粪样。例如，威斯康星州沃沃特萨的Agro BioSciences公司的生物化学家Noah Zimmerman对多酚这类在水果和蔬菜中种类和含量都很丰富的天然产物如何影响微生物群落比较感兴趣。为了帮助她，BioCollective公司招募了一批志愿者，并请他们在提供样品前的一个月，保持高多酚饮食。
一旦研究人员拿到样本，他们就可以选择基因组分析的方式了。如果他们不想自己去测序，他们可以选择外包服务。有很多外包研究机构都愿意帮忙处理基因组测序和分析工作，例如马里兰州罗克韦尔市的CosmosID，德克萨斯州休斯顿市的Diversigen，和加利福尼亚州旧金山市的Second Genome Solutions。
对于纯种的生物体，可以通过简单的基因组或转录组测序来识别其基因表达模式。CosmosID公司的副总裁兼研发部门主管Nur Hasan指出，仅这一项工作就会产生大量有深度的信息。这家公司可以对客户提供的纯培养微生物进行测序，然后进行生物信息学分析，并提供一系列数据，例如它在微生物的系统发育树上所处的位置，它携带什么抗生素抗性基因，以及它携带的毒力因子等等。
Diversigen公司的业务发展总监Jean-Philippe Laine指出，对于那些开发食用或药用微生物的公司来说，了解微生物的完整序列是至关重要的。
长颈鹿疣
虽然Diversigen公司使用的二代测序仪仍然很受欢迎，但2015年以来市场上已经有了另一种选择，就是Rhodes使用的MinION，这是由英国的Oxford Nanopore Technologies生产的一款测序仪。它通过膜中的纳米孔供给DNA链，同时让一个电流通过这些毛细孔。由于腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤等碱基通过毛细孔时，对电流的改变会有细微的差别，因此MinION能够读取通过毛细孔的DNA序列。
这个装置比一个U盘稍大一点，可以通过众多微孔同时读取多条DNA链，并收集较长片段的序列信息，这与短片段的鸟枪测序不同，这一优势使得MinION特别适用于拼接完整的微生物基因组。
当兽医们从南非和丹麦的动物园给Piet Maes寄来长颈鹿面部病灶的神秘样本，MinION就成了这位比利时鲁汶大学的分子病毒学家所需的完美解决方案。Maes和他的团队原本更倾向于用他们常用的传统二代测序仪对这些样本进行检测，他们甚至宁可等到40~160个样品全部分析完成。
但由于实在迫切地想要知道长颈鹿样本的测序结果，Maes实验室的博士生Bert Vanmechelen点亮了MinION。他解释说：“用这个我们可以在自己的电脑上做测序，第一天准备好样品，第二天就能得到结果。”在这么短的时间内，他就能够对一种新型的乳头状瘤病毒的基因组进行测序，研究人员将其命名为长颈鹿乳头状瘤病毒。Maes解释说这种病毒没有什么好的治疗方案，所以长颈鹿需要做手术来移除病灶，但是知道感染并不会严重恶化也很有意义。
MinION还具有现场检测能力；在最近的非洲埃博拉病毒暴发期间，它被用来追踪病毒的进化过程，甚至被运载火箭带上了国际空间站。
获取宏基因组数据
Rhodes和Vanmechelen都只是有一个单一的微生物需要测序，但是对于一组生物体来说，测序要复杂得多。罗克韦尔市Synthetic Biologics公司的副总裁Sheila Connelly说，微生物学家似乎正在逐渐从依靠rRNA基因识别出微生物种类，转向更深度的全基因组测序。她一直和CosmosID合作，研究抗生素是如何改变猪的肠道微生物组——这是一个重要的医学问题，可能会引发像梭状芽胞杆菌这样的机会性感染。
合作研究团队采用了一种宏基因组学方法，对Connelly的猪粪样本中所有DNA进行了鸟枪测序。得到的是一份预测群落中细菌种类及其相对丰度的列表，以及可能存在于整个群落的抗生素耐药基因。Hasan说，基于我们精心管理的标准微生物基因组数据库，CosmosID能够将这些信息（例如微生物群落中的物种和菌株）提供给客户。
Connelly和同事们不仅从CosmosID的数据中发现了抗生素如何改变猪肠道内细菌的分布，而且还观察到了抗生素耐药性的群落概况。Connelly说，由此，他们可以知道如何用抗生素头孢曲松来治疗那些似乎对很多药物有耐药性的微生物。
对于猪的研究有力地推动了Synthetic Biologics公司的拳头产品ribaxamase的研发。该公司希望能利用这种口服药物来保护肠道菌群免受某些静脉注射抗生素的影响，因为这些抗生素可以杀死大量的健康、有益的微生物群落，并打开有害微生物入侵的大门。这种药物停留在胃肠道，对任何进入肠道的静脉注射抗生素都有降解作用，但不会渗透到抗生素正常工作的身体的其他部位。在人体试验中，ribaxamase已经证实可以减少梭状芽胞杆菌感染。
像Synthetic Biologics一样，Second Genome Solutions公司的首席商务官Mohan Iyer认为，他们的公司也专注于将微生物基因组知识转化为医疗方案。例如，Second Genome Solutions比较了微生物及其功能，他们分析了溃疡性结肠炎加重患者，结肠炎控制良好的患者和健康人群的胃肠活检组织。
通过基因组和转录组测序，研究人员在健康和发炎的肠道中发现了哪些细菌存在，哪些基因表达。基于此，他们发现了哪些由细菌产生的生物分子可以促进或抑制炎症。Second Genome Solutions开发的新型消炎药目前正处于一期临床试验阶段。
有人要FishTaco吗?
像Second Genome Solutions、CosmosID和Diversigen这样的公司可以完成从样本准备和测序到生物信息学分析的所有工作，这使得科研人员即使缺乏相应的专业知识，也能对微生物基因组进行研究。但拥有准确专业知识和兴趣的研究人员已经开发出了他们自己的新工具，并将这些工具和整个科学共同体分享。
但是问题在于，大多数分析工具都只是解决两个问题中的其中一个：“谁在样本中？”或者“作为一个群体，群落包含哪些基因？”西雅图华盛顿大学的计算生物学家Elhanan Borenstein说：“每一个都只是故事的一半，把这两个数据集整合在一起并不容易。”问题在于不同的生物分类群体在不同人的微生物群体中执行了相同的功能。他的实验室最近提出了一种解决方案，一种称为“功能性转移的分类学贡献者”的计算方法（简称FishTaco）。
首先，FishTaco根据已知的基因组信息对微生物样本中所有分类组别进行研究，并指出宏基因组测序中的哪些基因来自哪些微生物。当个体生物的基因组信息缺失时，它还可以推断出哪些基因属于哪个物种。
然后，FishTaco利用这些信息帮助研究人员确定哪些物种或物种群体与他们正在比较的微生物宏基因组之间的关键差异有关。例如，Borenstein和同事们对比了2型糖尿病和健康人肠道微生物的宏基因组序列。宏基因组数据显示，糖尿病人的菌群样本中糖转运蛋白基因丰度要比健康人的高得多，但究竟是哪些细菌在完成这些多出来的糖处理工作呢？FishTaco鉴定出埃希氏菌属和双歧杆菌属分别对不同种的糖类转运负责。
Borenstein说，这种信息可以帮助研究人员勾勒一幅通过菌种再平衡的方式来获取所需要的功能，并进而改善健康状况的蓝图，比如利用抗生素或益生菌等疗法。他说：“它打开了一扇通往更加订制化和个性化的干预方法的大门。”
休斯顿的德克萨斯儿童医院附属贝勒医学院和德克萨斯儿童微生物组中心的微生物生态学家Emily Hollister说，微生物学家目前很少进行这种综合分析，尽管他们经常对于哪些细菌在执行群落中的哪些功能进行有根据地猜测。她正将FishTaco应用于自己对肠道和呼吸道微生物失衡的研究。
Hollister说：“我们鉴定出的这些差异可能会为潜在的诊断或治疗靶点开发提供思路。”■
（译者李楠是欧宝体育APP下载：深圳先进技术研究院副研究员。）
Amber Dance是一位生活在洛杉矶的自由作家。
DOI: 10.1126/science.opms.p1700115
鸣谢：“原文由美国科学促进会（www.aaas.org）发布在2017年5月19日《科学》杂志”。官方英文版请见http://www.sciencemag.org/features/2017/05/mining-microbes-creating-genomic-tools-fight-disease。
《科学新闻》 (科学新闻欧宝体育平台：6月刊 科学·生命)
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