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作者：王晓刚 张金磊 来源： 发布时间：2018-8-1 14:56:28
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将外源分子注入单细胞以及对细胞内部做力学研究是细胞生物学的研究热点之一，但是做到这些的前提是将针尖刺入到细胞内部。
然而，大量实验表明，由磷脂双分子层构成的细胞膜就像一道神奇的屏障，即便是比头发丝细一千倍的纳米针也很难刺入，成功扎透细胞膜的概率在20%~80%之间，有时候甚至怎么都扎不进去。小小细胞隐藏着诸多奥秘，细胞膜究竟具有怎样的力学特性实在令人难以捉摸。
近日，电子科技大学机械与电气工程学院教授彭倍团队青年教师范娜博士从细胞生物力学的角度，为彻底解开这个谜团带来了全新的思路，发现了纳米针尖和细胞膜相互作用时的刺入机理，并找到了两种大幅度提高刺入率的诀窍。
这项研究发表在国际著名期刊Small上，范娜为论文的第一作者，副教授姜海为共同第一作者，彭倍为论文联合通讯作者，电子科技大学机械与电气工程学院为研究的第一作者单位和通讯作者单位。
发现科学问题
刺入活体细胞，探究生命的奥秘是欧宝体育平台家的梦想。而如何给人体普遍存在的成纤维细胞注入药物、蛋白质或转录因子，以诱导这些普通的细胞变成“万能”的诱导多能干细胞，则成为越来越强烈的需求。
“设想一下，只要取一个成纤维细胞，比如普通的皮肤细胞，就可以诱导产生干细胞进而分化成完全没有免疫反应的全新的眼角膜、全新的皮肤、全新的器官，这将是多么奇妙的事情！”范娜说，“这项技术一旦成熟，将会为人类的生命和健康事业带来巨大的福祉！”
有了这一技术，人类研发和测试新药就可以摒弃传统的、饱受伦理诟病的动物活体试验，而是通过体外培育特定的人体细胞组织来进行高通量的药物测试。这样既可以大大缩短测试新药的时间，也可以更加准确地了解药物的效用。
然而，细胞膜的存在给欧宝体育平台家进入细胞内部设置了一道巨大屏障。这层薄膜主要由磷脂双分子构成，虽然厚度仅为8~10纳米，但却具有半透性且富有流动性。在针刺方法诞生之前，要想突破这层防线，就得派遣“比针尖还小一万倍”的“特洛伊木马”，即让携带转录因子的病毒对细胞进行转染。
但是，使用病毒转染的方式存在致癌风险且转染成功的概率仅为1%，尤其是很难区分哪些细胞已被转染、哪些细胞未被转染，转染程度也无法进行精确的量化控制。因此，科学家逐步探索出了无病毒、非破坏性、可量化控制的新方法，即给细胞“打针”，直接把药物、蛋白质或转录因子精准地注入单个细胞内部。
范娜在梳理学界给细胞“打针”的研究成果时发现，纳米针要刺入细胞膜并不容易，刺入效率的范围低时可至20%，高时可达80%，浮动区间很大。虽然生物学家已经注意到这个现象，但却“知其然而不知其所以然”。
因此，她敏锐地意识到，生物力学的研究方法或许可以为解释这个现象提供新的思路和科学依据，进而找到提高刺入率的有效方法，为生物学家探索细胞内部的奥秘提供理论和技术支持。
亲自动手扎针
“纸上得来终觉浅，绝知此事要躬行。”给细胞“扎针”到底有什么样的力学特征？范娜认为，要了解这些信息，首先得自己动手扎一扎。纳米针和成纤维细胞都很容易购买，在实验室里完全可以重复前人的研究。
纳米针的学名叫做原子力显微镜探针（AFM tip），其针尖直径一般为20~100纳米，小到肉眼根本无法看见。这种设备十分灵敏，可以测量到很微小的力——纳牛（nN），我们手指轻敲键盘的力约为7亿纳牛。
有了灵敏的纳米针，就可以开始给细胞“打针”了。研究人员先给纳米针设定一个力值“开关”，然后从针尖接触到细胞膜开始逐渐下压，加载力也因此逐渐增加。当力的大小达到“开关”位置时，纳米针就会立马弹回来，这个力就是所谓的“触发力”。
在逐渐用力的过程中，如果细胞膜没有被刺破，就可以把触发力提高一点再刺；如果细胞膜在某个力值被刺破了，力的变化曲线就会记录下这个数值，这个数值就是“刺入力”。实验中，范娜分别对30个活细胞进行针刺实验，每个细胞重复刺4次，一共得到120组数据。通过统计刺入和没有刺入的力曲线，得到了触发力、刺入力与刺入率之间的关系。
她分别测量了触发力为1纳牛、3纳牛、5纳牛、8纳牛时的刺入力，每个力值得到120组力曲线数据。通过分析、统计实验数据，她发现：刺入力远低于触发力，而且，刺入率与触发力也不成正比。
当触发力为5纳牛时，刺入率达到最高的15%；再增大触发力，刺入力依然在1.3纳牛附近徘徊，刺入率反而下降到了12.5%。也就是说，无论加载的力道或大或小，刺入力总是偏向于一个比较稳定的值，不会随触发力的增加而增加。
按照一般的理解，扎针所用的力越大，肯定越容易扎透。如果画一条曲线，那么，刺入力肯定是在加载力最大的时候刺破细胞膜的。然而，实验数据表明，这个“常识”是不可靠的。
范娜提出了一个假说：在探针压入细胞的过程中，细胞膜的应力不是持续增加的，可能存在分段的现象，细胞膜的应力达到一定的数值就保持不变了，只有这样才能解释刺入率不随外界载荷增加而增加且刺入力远小于触发力的现象。
探秘细胞膜结构
既然把细胞想象成“皮球”无法解释实验数据，那么，细胞膜的应力变化和细胞膜的结构特征肯定还有其他的可能。为了解释这种可能，范娜在大量实验的基础上，建立了细胞膜“骨架”模型，提出了“细胞膜应力分段效应假说”并加以实验验证。
然而，应力是“单位面积上的内力”，无法直接测量出来。因此，若要验证猜想，需要构建合适的数值模型来准确计算。而要构建数值模型，首先得了解细胞的结构。
已有研究显示，细胞膜下有一层肌动蛋白丝，像“栅栏”一样把细胞膜分隔成许多隔室。不同类型细胞的肌动蛋白网格大小各有不同，范围从30纳米到230纳米不等。早在1983年就有生物学家拍下了摩尔比为1：50的肌动蛋白/细丝蛋白网络的电子显微镜照片。
再加上微管的支撑，细胞膜就神奇地有了“骨架”。范娜比喻说：“在微管和肌动蛋白丝的支撑下，细胞其实更像一顶帐篷。”
问题是，这种“骨架”结构对细胞膜应力的影响有多大？虽然在2010年已经有研究表明，细胞膜下的肌动蛋白丝可能对能否刺入十分重要，但是该项研究并没有对此作出精确的量化描述。
经过实验与有限元分析，范娜证实，由于细胞膜骨架具有网格结构，细胞膜在针刺过程中的应力呈明显的分段现象（应力分段点S）。在应力分段点S之前，细胞膜的应力增加很快，之后趋于稳定。如果细胞膜在S点之前不能刺入，就很难再刺入了。因此，要提高穿透率的最好方法，就是提高第一阶段细胞膜的应力。
如何提高第一阶段细胞膜的应力？原理其实很简单，一种方法是增加细胞膜上的表面张力。研究人员给细胞表面刷了一层“胶水”——“鼠尾胶原I型蛋白”，这样就把软塌塌的细胞膜绷紧了一些，使其更容易被扎破。另一种方法是减少纳米针与细胞膜之间的接触面，通俗地说，就是让针更细、更尖锐。
实验显示，没有经过任何处理的细胞，刺入力为1.23±0.49纳牛，刺入率只有13%；而给细胞涂上“胶水”之后，刺入力减小到0.86±0.32纳牛，刺入率却提升至39%；如果用更加尖锐的纳米针，刺入力可减小到0.58±0.13纳牛，刺入率高达70%。
执着的信念
从2015底年开始关注这一问题，到欧宝体育平台：终于做出成果，范娜与团队成员用了2年多的时间终于揭开了给细胞“扎针”的谜团。对此，论文评阅人给出了高度评价：“这是世界上第一次用细胞生物力学方法对细胞膜的应力给出精确、量化的描述。”
做出这项成果并不容易。2013年，范娜加入电子科大彭倍团队，虽然此前在读博期间接触过生物力学，但她研究的主要方向还是髋关节的摩擦噪声问题，深入到纳米量级研究生物力学，对范娜来说还是第一次。最终，她选择了一个生物力学和纳米力学交叉的切入点——细胞。
“其实，我们课题组没有一个老师有细胞研究方面的学术背景，更不用说开展这种活体单细胞研究了。” 范娜说，一切都是从零开始的：从零开始梳理文献，从零开始学习请教，从零开始寻找合作。
没有纳米细针，就找上海的某研究所加工；不懂细胞刺入方法，就去重庆大学生物工程学院寻求合作。遇到难题或瓶颈，就找彭倍、姜海讨论，并发动团队内的博士、硕士一起想办法，进行思想碰撞、头脑风暴。
精准操控原子力显微镜给单个细胞“扎针”也是一个高难度的技术活。由于纳米针很细、很脆而且价格不菲，因此，“扎针”时要求操作很稳很准，否则针头一旦折断，买针头的钱就打水漂了。设定每一个触发力，都要进行预实验和正式实验，整个实验下来，范娜给细胞“扎针”的次数就达到了成千上万次。
由于实验方案需要和合作单位共同商榷，因此，在做实验的半年时间里，范娜经常往返于电子科大和重庆大学。后期的数据整理、统计和分析的工作量也非常巨大，团队的博士生、研究生甚至本科生都积极参与了进来。光是论文的撰写（包括图片和图表制作），范娜和姜海就足足修改了32遍。
论文投稿后，他们共收到3位审稿人的反馈意见。其中一位审稿人高度赞扬了这项工作；另一位审稿人对论文写作的细节性问题提出了建议；还有一位审稿人从应用前景的角度提出质疑，认为纳米针价格昂贵，难以推广应用，该项研究意义不大。对此，范娜毫不胆怯，先后两次据理力争，向专家阐述了这项工作的重要意义，并最终说服了专家。欧宝体育平台：5月，论文最终得以在Small上发表。
“细胞生物力学是一个交叉学科，可以破解生物学家以前遇到的许多难题，至少可以提供新的视角和方法，为欧宝体育平台的研究提供有力帮助。”范娜引用“生物力学之父”冯元桢先生的话与所有的青年学人共勉：“听从自己内心的声音，永不放弃对未知的探索。生命不息，奋斗不止！”■
（作者单位为电子科技大学）
《科学新闻》 (科学新闻欧宝体育平台：7月刊 进展)
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